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[转录组] 组学研究中的乐高——空间转录组

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    发表于 2019.12.26 14:24:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
    空间转录组是近两年谈论很多的新组学技术,受到很多顶尖实验室的追捧。那么,空间转录组有什么特殊之处吸引了这么多的关注呢?今天就由我带大家一起来看看空间转录组技术。文末有福利,不要走开哦~

    1、为什么要做空间转录组?

    空间转录组,正如其名,是以分析样本内部不同空间位置转录组信息为目的的技术,与普通转录组和单细胞转录组相比进一步提高了样本内部分辨率。

    组织是由多种多样的细胞构成的。普通转录组将所有细胞的RNA混合进行测序,这样的平均化结果带来的弊端已经被单细胞转录组证实;单细胞转录组给了样本RNA“归属”,细胞水平的差异分析打开了新世界大门,但是这一个个细胞之间的联系依然是断的,难以还原回真实样本状态。

    空间转录组技术的出现实现了“搭积木”的可能性。该技术将样本中每个空间位置有序记录下来,获得的转录本信息最终可以对应回组织位置。在这样的条件下,还原组织内部的各空间位置的基因表达状态,接近单细胞级的分辨率建立起了细胞之间的关联关系。

    空间转录组在保留胞间关联关系的同时,也保留了细胞微环境信息,具备了解析样本空间异质性的潜力。正是这样的全新视角使得很多研究者被它所吸引。

    2、10X Visium 空间转录组原理

    10X Visium将组织切片与转录组测序结合,实现空间信息和转录本信息的获取。

    10X Visium使用特制的玻片,玻片上有捕获区域(capture area),捕获区域是一个6.5*6.5mm的正方形区域,每个捕获区域包含约5000个spot,每个spot上结合有捕获序列,捕获序列有barcode序列记录spot位置信息和poly(dT)序列结合mRNA的poly(A)尾,在捕获mRNA的同时也保留了mRNA的位置信息。转录本的位置信息结合染色拍照结果即可还原转录本在组织的位置分布。

    图1 10XVisium原理示意图

    3、10X Visium空间转录组实验流程

    10X Visium的实验可以分为两个板块——组织学板块和组学板块。组织学板块包括样品的包埋、切片、固定、染色及成像,记录切片的形态学信息;组学板块包括cDNA的合成、扩增、接头连接和测序,记录切片的转录本信息和空间位置信息。

    图2 空间转录组建库流程总览

    (1)样本准备

    样本准备主要包含组织学板块的工作。

    组织切片使用冷冻切片的方式最大程度上保护转录本信息的完整性。在组织包埋时,将欲使用的组织切面修到6.5*6.5mm以内,以适应捕获区域。将组织放入液氮浴的异戊烷中完成冷冻,转入干冰环境使用OCT包埋剂包埋。在冷冻切片机中完成组织包埋块的温度平衡后开始切片,使用10μm的厚度将切片放置到特殊玻片上。

    其后,对玻片上的切片进行固定和染色。切片的固定一般使用预冷甲醇通过脱水反应实现,染色一般使用伊红&苏木精染色法(HE染色)。

    完成染色的玻片通过85%甘油封片后使用明场显微镜进行拍照。拍照需要注意调整曝光时间和拍摄范围,使得捕获区域的边界和spot在成像结果可见。成像结果在后续的数据分析中起着重要作用,边界的点形状决定了图片的正方向,spot的位置决定了空间位置排布。

    图3 组织成像结果

    (2)组织优化

    不同组织类型的结构蛋白不同,也导致组织透化所需时间有所不同,组织优化就是针对组织透化时间进行的。组织优化与一般建库步骤有两点不同:①反转录时使用的dNTP带Cy3荧光基团,用于评定组织透化程度;②成像之前需要去除组织,组织有自发荧光会干扰荧光成像。

    在去除组织后使用荧光显微镜进行成像,最佳组织透化时间通过三个条件决定:
    ①荧光信号最强;
    ②荧光信号弥散最弱;
    ③前两个情况一致的情况下选择较长的组织透化时间

    图4 组织优化结果

    (3)文库制备

    文库制备从组织透化开始,组织透化时间由组织优化实验确定。组织透化之后即可进行反转录和二链合成;合成的二链通过碱性环境变性从玻片上游离并作为后续cDNA扩增的模板。扩增后的cDNA经过片段化、添加接头、纯化完成测序文库的构建。

    图5 文库制备流程

    4、空间转录组适用范围

    空间转录组适用于大多数研究领域,包括但不限于神经生物学、肿瘤发生、免疫学、病理学、毒理学、再生医学、发育生物学。

    ST技术创立的文章就是基于大脑结构的研究[1]。随后,研究人员成功使用ST技术研究了心脏的发育和肿瘤的发生发育[2][3][4][5]。今年,纽约基因组中心通过ST技术对肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的发病机制进行了探究。相信未来还有更多领域的文章会利用空间转录组。

    空间转录组是在组织切片的基础上使用组织酶解的方式完成组织透化的,所以,真正限制空间转录组应用范围的是组织类型。现在经过10X公司的测试,绝大多数组织类型都可以进行空间转录组,皮肤和骨骼还在尝试之中。

    在过去一年中,基迪奥针对单细胞悬液制备建立了近50种个性化方案,在酶的使用和个性化实验方案设计上积累了大量的经验。在空间转录组的适用性上,基迪奥也将继续配合客户解决组织适应性问题。

    5、空间转录组数据分析

    此前,空间转录组一直没有普及开,除了技术难度限制外,数据分析缺乏成熟软件也是一个重要因素。

    现在,空间转录组下游数据分析可以由10X官方软件spatialranger完成数据比对、loupebrowser完成基础的可视化操作。这两个软件都是“傻瓜式”操作方式,按照指引就可完成相关数据分析。同时,spatial ranger输出的稀疏矩阵信息也可以通过R包Seurat完成个性化分析[2]。

    图6 spatial ranger网页结果


    图7 loupebrowser界面

    基迪奥在今年九月份于业内第一个推出了10X单细胞在线分析平台,在个性化平台搭建上有丰富经验,后续我们也将针对空间转录组推出在线分析平台,简化个性化分析操作。 作为新组学新技术,空间转录组的分析切入点将会是文章的一大亮点,基迪奥将凭借多年个性化数据分析经验,助您登上高分文章的发文起点。

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    学习啦
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    发表于 2019.12.27 10:14:32 | 显示全部楼层
    感谢,大神分析。
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    动植物组织都可行?
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    微生物可以吗
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    ganxie分享
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    好棒
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    [LV.2]偶尔看看I

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